· poliakrilamidgel mošt akrilamidnim monomerom, polaznim materijalom za polimerizaciju, katalizatorom i mješavinom soli i pufera zajedno.
· akrilamidi BIS (N,N'-metilen dvostruki akrilamid) je gel matrica u obliku monomera.
· Amonijum persulfat započinje proces adhezivne polimerizacije. Formulacija ljepila zahtijeva 10% otopinu amonijum persulfata pripremljenu u vodi. Većina informacija je ukazivala na potrebu za aktivnom upotrebom. Međutim, 10% rastvor se može staviti na 4℃ nekoliko nedelja bez značajnog gubitka aktivnosti. Dopunite do 10 ml i bacite kada se ljepilo ne agregira.
Savjet: postotak odakrilamidu sekvenciranju ljepilo i proteinsko ljepilo nije isto. Ako koristite gotovi akrilamid: BIS otopinu, pobrinite se da nabavite pravu bocu.
· TEMED (N,N,N',N'-tetrametil etilendiamin) je katalizator, u smeđoj boci, stavljen u frižider. Dodajte neposredno prije nanošenja ljepila.
· Poliakrilamidnu elektroforezu staklo koje se koristi u elektroforezi treba prati svaki put prije i poslije. Nakon elektroforeze, operite mekom četkom i krpom u vrućoj vodi sa sapunom, isperite destilovanom vodom i ostavite da se osuši.
· Vlaga i prašina mogu uzrokovati šuplji polimer. Prije elektroforeze očistite staklenu ploču sredstvom za čišćenje stakla i obrišite je mekom četkom. Operite destilovanom vodom i dobro osušite papirnom maramicom. Ispiranje sa 70% etanola prije brisanja papirom pomaže u čišćenju i ubrzavanju sušenja. Dodajte uzorke akrilamida sukcesivno: BIS, voda, puferski rastvor, amonijum persulfat, TEMED. Dobro promućkajte i odmah sipajte.
Nije potrebno otplinjavati poliakrilamid prije polimerizacije. (Akrilamid se nekada stavljao u vakuum kako bi se uklonili mjehurići jer kisik inhibira polimerizaciju.)
Horizontalni vrhovi uzorka tačke lepljenja.
· stavite komad crnog papira u donju kutiju, crnu pozadinu da napravite rupu za uzorak kako biste jasnije vidjeli.
· Pufer pun rezervoara lepka, neposredno iznad koloida.
· ako rub ima svjetlo, upaliti svjetla, neka svjetlost sija koloidno. Uvucite uzorak u pipetu.
· korištenjem automatskog pipetiranja.
· u 10-200 mu 1 tečna pokretna tačka može se koristiti u većini tačaka na uzorku. Za vrlo male rupe za uzorke (manje od 10 μ1), dugačka glava pipete koja se koristi za sekvenciranje ljepila je prikladnija.
· pipetiranje upravo uronjeno u uzorak, udisanje tečnosti koja se sporo kreće. Uzorak može izgledati ljepljiv s glicerinom, a brzo pumpanje može uvući mjehuriće zraka u glavu pipete.
· Uzorci će nakon udisanja glave za pipetiranje lagano pomicati glavu tekućine na rub cijevi ili će brisanjem papira usisati glava tekućine izvan kapljica. Pazite da ne usisavate uzorak.
Stavite uzorak u otvor za uzorak
· Uređaj za pipetiranje da zadrži mali pritisak, učini da se uzorci lagano pomaknu preko glave tečnosti.
· glava za pipetiranje umetnuta u pufer, malo viša od otvora, održava pozitivan pritisak. Vrh pipete se može umetnuti u malu rupu.
· polako i postojano uzorci izlaze. Vrh pipete se postavlja iznad otvora za uzorak i uzorak će potonuti u rupu. Pustite da uzorak potone kako bi ispunio rupu uzorka umjesto da gurate unutra.
· nakon zadnje kapi uzorka sa tečnom glavom, tečnost će se pomeriti na drugu nogu, polako podići tečnost se pomeriti, izaći iz pufera
Kako napraviti vertikalno uzorkovanje ljepila?
· vertikalne rupe za uzorke zalijepljene između dva komada stakla. Kod vrlo tankog ljepila, glava pipete se ne može ni umetnuti između dvije staklene ploče. Pazi na glicerin! Stavite glavu pipete preko otvora za uzorak i uzorak će potonuti u rupu.
· točka uzorka prije, obavezno stavite vertikalnu tačku polipropilenskog acil gela rupa uzorka je isprana. Isperite nepolimerizovani akrilamid i vodu koja se može pojaviti na dnu rupe za uzorak. Voda može učiniti rupu uzorka znatno manjom. Koristite špric od 25 ml ili 50 ml i iglu od 18. Ulijte pufer za elektroforezu i pažljivo isperite rupu uzorka.
· može biti teško vidjeti rupu uzorka, ali u isto vrijeme, ostalo je lako. Ako ima viška rupa, pufer za uzorke se može testirati bromofenol plavim.
Vrijeme objave: Mar-31-2023