· poliakrilamidGel se mora sastojati od akrilamidnog monomera, početnog materijala za polimerizaciju, katalizatora i smjese soli i pufera.
· akrilamida BIS (N, N'-metilen dvostruki akrilamid) je monomer u obliku gel matrice.
· amonijum persulfat započinje proces polimerizacije ljepila. Formulacija ljepila zahtijeva 10% rastvor amonijum persulfata pripremljen u vodi. Većina informacija ukazuje na potrebu za aktivnom upotrebom. Međutim, 10% rastvor se može držati na 4℃ nekoliko sedmica bez značajnog gubitka aktivnosti. Dopuniti do 10 ml i baciti kada se ljepilo ne agregira.
Savjet: ProcenatakrilamidU sekvenciranju, ljepilo i proteinsko ljepilo nisu isti. Ako koristite gotovu otopinu akrilamida:BIS, provjerite da li imate pravu bocu.
· TEMED (N, N, N', N'- tetrametil etilendiamin) je katalizator, u smeđoj boci, smještenoj u frižider. Dodati neposredno prije sipanja ljepila.
· Staklo korišteno u poliakrilamidnoj elektroforezi treba prati prije i poslije svakog korištenja. Nakon elektroforeze, operite ga mekom četkom i krpom u vrućoj vodi sa sapunom, isperite destiliranom vodom i ostavite da se osuši.
· Vlaga i prašina mogu uzrokovati probleme sa šupljim polimerom. Prije elektroforeze, očistite staklenu ploču sredstvom za čišćenje stakla i obrišite je mekom četkom. Operite destilovanom vodom i temeljito osušite papirnom maramicom. Ispiranje sa 70% etanolom prije brisanja papirom pomaže u čišćenju i ubrzavanju sušenja. Redom dodajte uzorke akrilamida: BIS, vodu, puferski rastvor, amonijum persulfat, TEMED. Dobro protresite i odmah sipajte.
Nije potrebno degazirati poliakrilamid prije polimerizacije. (Akrilamid se ranije stavljao u vakuum kako bi se uklonili mjehurići jer kisik inhibira polimerizaciju.)
Uzorci vrhova za horizontalne ljepljive tačke.
· Stavite komad crnog papira u donju kutiju, s crnom pozadinom, kako biste napravili rupu za uzorak i jasnije vidjeli.
· pufer napunjen rezervoarom za ljepilo, odmah preko koloida.
· ako rub ima svjetlo, upalite svjetla, pustite da svjetlost obasja koloid. Uvucite uzorak u pipetu.
· korištenjem automatskog uređaja za pipetiranje.
· u 10-200 mu, 1 tečna pokretna tačka se može koristiti u većini tačaka na uzorku. Za vrlo male otvore uzorka (manje od 10μ1), dugačka glava pipete koja se koristi za sekvenciranje ljepila je praktičnija.
· pipetiranje samo uronjenim u uzorak, udisanje tečnosti koja se sporo kreće. Uzorak može izgledati ljepljivo od glicerina, a brzo pumpanje može privući mjehuriće zraka u glavu pipete.
· Nakon udisanja uzoraka, glava pipete će lagano pomicati glavu tekućine po rubu cijevi ili papirom za brisanje kako bi se usisala glava tekućine izvan kapljica. Pazite da ne usisate uzorak.
Stavite uzorak u otvor za uzorak
· uređaj za pipetiranje održava mali pritisak, kako bi uzorci lagano pomicali glavu preljevne tekućine.
· glava pipete umetnuta u pufer, malo više od rupica za mjerenje pritiska, održava pozitivan pritisak. Vrh pipete se može umetnuti u malu rupicu.
· Polako i postojano izvlačite uzorke. Vrh pipete se postavlja iznad otvora za uzorak, a uzorak će potonuti u otvor. Pustite da uzorak potone kako bi se ispunio otvor za uzorak umjesto da ga gurate unutra.
· Nakon što posljednja kap uzorka padne na tečnu glavu, tečnost će se pomjeriti na drugu nogu, polako podižući kretanje tečnosti i izlazeći iz pufera.
Kako izvršiti vertikalno uzorkovanje ljepila?
· vertikalne tačke lijepljenja formirane su rupe za uzorke između dva komada stakla. Kod vrlo rijetkog ljepila, glava pipete se ne može ni umetnuti između dvije staklene ploče. Pazite na glicerin! Stavite glavu pipete preko rupe za uzorak i uzorak će utonuti u rupu.
· Prije uzimanja uzorka, obavezno isperite otvor za uzorak od polipropilen acil gela vertikalnom tačkom. Isperite nepolimerizirani akrilamid i vodu koja se može pojaviti na dnu otvora za uzorak. Voda može značajno smanjiti otvor za uzorak. Koristite špricu od 25 ml ili 50 ml i iglu kalibra 18. Ulijte pufer za elektroforezu i pažljivo isperite otvor za uzorak.
· Može biti teško vidjeti otvor za uzorak, ali istovremeno, ostalo je lako. Ako postoji višak otvora, pufer za uzorak se može testirati bromofenol plavim.
Vrijeme objave: 31. mart 2023.